Создан заказ №3064731
27 мая 2018
Практика по молекулярной биологии, обзор статей
Как заказчик описал требования к работе:
Есть несколько научных статей на английском языке из области молекулярной генетики. Нужно написать по ним краткое резюме, которое будет использоваться в качестве отчета по практике. Что-то я перевела, но мне требуется помощь кого-то, кто уже работает научным сотрудником в одной из областей молекуляр
ной биологии и понимает, как выполняются задания такого рода
подробнее
Фрагмент выполненной работы:
Введение
В настоящее время значительное внимание исследователей привлекает проблема взаимодействий между удаленными молекулами и роль этих взаимодействий в регуляции процессов экспрессии генов, в частности функциональных взаимодействий между энхансерами, сайленсерами и промоторами, которые нередко локализуются на значительном удалении друг от друга.
К настоящему времени описан особый класс «архитектурных «белков, включающий инсуляторы, которые способны регулировать локальные взаимодействия между энхансерами и промоторами. (работа была выполнена специалистами Автор 24) Для поддержания специфических взаимодействий на больших расстояниях белки-инсуляторы должны иметь домены гомодимеризации, такие как ВТВ-домен, GAF-домен и Mod-домен. Кроме того многие инсуляторы выполняют барьерные функции и могут ограничивать зоны локализации гетерохроматина и репрессированных генов, в частности для ограничения репрессивного эффекта Polycomb-элементов.
Уникальные возможности для изучения подобных взаимодействий предоставляет модель дрозофилы. Возможности транспозон-опосредованной трансформации и манипуляции с рекомбинантными системами позволяют анализировать различные комбинации регуляторных элементов в одной и той же позиции в геноме и изучать роль регуляторных элементов по экспрессии репортерных генов. К примеру, одной из наилучших модельных систем для изучения роли инсуляторов является регуляторный регион гомеозисного гена Abdominal-B (Abd-B) комплекса bithorax.
Проанализированные работы посвящены анализу пространственной организации и функциональных взаимодействий некоторых белков-инсуляторов и их доменов мультимеризации.
Материал и методы
Очищенные рекомбинантные белки и домены (например, ВТВ-домен), выделенные из бактериальных клеток, анализировали с помощью гель-фильтрующей хроматографии и электрофореза непосредственно в неденатурированном состоянии. На следующих этапах для улучшения фолдинга и повышения растворимости ВТВ-домена использовали его слияние с тиоредоксиновым тагом.
Для получения трансгенных штаммов бактерий использовали соответствующие фрагменты ДНК, которые получали путем амплификации кДНК клеток HEK293 (Bcl6, Miz1, and ThPOK) или кДНК клеточной линии Шнайдера (Schneider line 2 cells), в случае белков дрозофилы. Для трансфекции использовали вектор pET32a(+).
Двугибридный анализ проводили с использованием штамма дрожжей pJ69-4A, плазмид и протокола Clontech. Для анализа роста проводили трансфекцию дрожжевых клеток плазмидами по литий ацетатному методу в соответствии с рекомендациями производителя и помещали клетки в среду, не содержащую триптофан и лейцин. Через 3 сут роста при 30 °C клетки помещали в селективные среды без триптофана, лейцина и гистидина и сравнивали их рост через 2-3 сут в присутствии или отсутствии 5 mM 3-аминотриазола (3-AT).
Для получения трансгенных мух интересующие конструкции и плазмиды (например, P25.7wc) инъецировали в эмбрионы yacw1118 на стадии пребластодермы. Полученных мух скрещивали с мухами yacw1118 и трансгенных потомков отбирали по цветным глазам. Линии с вырезанными фрагментами ДНК были получены путем скрещивания с мухами, несущими транспозоны с FLP (w1118; S2CyO, hsFLP, ISA/Sco; +) или Cre (yw; Cyo, P[w+,cre]/Sco; +).
Для индукции экспрессии GAL4 использовали модифицированную линию yw1118; P[w+, tubGAL4]117/TM3,Sb, в которой маркерный ген mini-white был удален. Для определения уровня экспрессии гена white проводили визуальную оценку степени пигментации глаз у самцов в возрасте 3-5 дней, развивающихся при 25 °C. Дикий тип имел ярко-красные глаза, в отсутствии экспрессии гена white глаза были белыми.
Для иммунопреципитации хроматин выделяли из куколок среднего возраста. Образцы, хранившиеся в жидком азоте, ресуспендировали в буфере А [15 mM Hepes—KOH (pH 7.6), 60mM KCl, 15mM NaCl, 13 mMEDTA, 0.1mM ethylene glycol bis(β-aminoethyl ether) N,N′-tetraacetic acid (EGTA), 0.15mM spermine, 0.5m M spermidine, 0.5% NP40, and 0.5 mM DTT], содержащем 0.5 mM PMSF и Complete (EDTA-free) Protease Inhibitor Cocktail V (Calbiochem). Суспензию гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса с пестиком В и фильтровали через нейлоновый клеточный фильтр. Гомогенат переносили в 3 мл буфера А с 10% сукрозы и ядра осаждали путем центрифугирования при 4000g при 4 °C в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в буфере А, повторно гомогенизировали и переносили в 1,5 мл буфера с сукрозой, после чего ядра осаждали центрифугированием. Ядра ресуспендировали в промывочном буфере [15 mM Hepes—KOH (pH 7.6), 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 0.1% NP40, и ингибиторы протеаз] и обрабатывали 1% формальдегидом 15 мин при комнатной температуре для формирования поперечных сшивок. Процесс останавливали добавлением глицина в финальной концентрации 125 mM. Ядра промывали в трех порциях промывочного буфера, ресуспендировали в 1.5 мл лизирующего буфера [15 mM Hepes (pH 7.6), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, and protease inhibitors], и подвергали действию ультразвука (серия 5×20 с интервалом в 1 мин). Дебрис удаляли центрифугированием при 14,000g, 4 °C, 10 мин. Хроматин предварительно очищали в протеин G агарозе, блокировали в растворе бычьего сывороточного альбумина и ДНК спермы лосося.
Образцы хроматина инкубировали с соответствующими антителами (например, крысиными антителами против GAF (1:200) и с неспецифическими IgG, выделенными из преиммунный сыворотки крыс), в течение ночи при 4 °C, затем комплексы хроматин—антитела собирали, используя белок G агарозу при 4 °C в течение 5 ч. После нескольких раундов промывки в лизирующем буфере или в 500 mM NaCl, LiCl буфере [20 mM Tris–HCl (pH 8), 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP40, 0.5% sodium deoxycholate, и ингибиторы протеаз], и Tris–EDTA буфере, ДНК извлекали в буфере [50 mM Tris–HCl (pH 8), 1 mM EDTA и 1% SDS] и преципитированную ДНК экстрагировали фенол/хлороформом. Специфические ДНК-фрагменты анализировали с помощью PCR в реальном времени с использованием термоциклера CFX96 (Bio-Rad).
Также в работах использовали методы молекулярного докинга, РНК-интерференции, масс-спектрометрии, иммуноцитохимического анализаПосмотреть предложения по расчету стоимости
Заказчик
заплатил
заплатил
500 ₽
Заказчик не использовал рассрочку
Гарантия сервиса
Автор24
Автор24
20 дней
Заказчик воспользовался гарантией для внесения правок на основе комментариев преподавателя
30 мая 2018
Заказ завершен, заказчик получил финальный файл с работой
5
Практика по молекулярной биологии, обзор статей.docx
2020-07-01 00:33
Последний отзыв студента о бирже Автор24
Общая оценка
4.4
Положительно
Спасибо спасибо большое тебе 🌹🌹🌹🌹🌹🌹🌹, очень профессиональный автор, очень хороший человек, довольна, благодарна за помощь!!!
Диплом на отлично сдан
Хочешь такую же работу?
300 ₽
